Nascido no dia 6 de agosto de 1881, em East Ayrshire, na Escócia, ele trabalhou na Primeira Guerra Mundial como médico militar e ficou impressionado com o grande número de mortes causadas por feridas de arma de fogo, que resultavam em gangrena. Após a guerra, ele passou a pesquisar por um novo antisséptico que evitasse a agonia provocada pelas infecções durante a guerra.
Em 1928, descobriu a penicilina e de suas propriedades antibióticas. No ano seguinte, aprofundou sua pesquisa e publicou os resultados dos seus estudos no “British Journal of Experimental Pathology”, em 1929, porém não obteve reconhecimento nem recursos para aperfeiçoar sua descoberta. Mais tarde, Howard Walter Florey, Ernest Boris Chain e Norman Heatley criaram uma maneira de extração e de purificação da penicilina. Com isso, sua produção industrial começou nos Estados Unidos no início da Segunda Guerra. O feito rendeu a Fleming, Florey e Chain o Nobel de Fisiologia/Medicina de 1945. Fleming preferiu não patentear sua descoberta, pois julgava que assim seria mais fácil difundir esse medicamento.
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